-
Mikroskop confocal merujuk kepada sejenis mikroskop optik khas yang dapat merakam kepingan optik.
Dengan menerangi dan mengamati satu titik had difraksi tunggal, penghirisan optik direalisasikan dalam sistem confocal laser. Ini memerlukan kedua -dua segmen rasuk mempunyai tumpuan yang sama, jadi mereka adalah "confocal". Bertentangan dengan imej lapangan lebar, imej confocal tidak mempunyai defocusing kabur. Ini adalah kelebihan dalam dirinya sendiri, kerana imej sampel yang mendalam adalah jelas dan kaya dengan butirannya. Walau bagaimanapun, kelebihan yang paling penting ialah potensi visualisasi tiga dimensi dengan ciri-ciri mikroskopik. Selepas urutan imej diperolehi di sepanjang Z-stack, objek 3D dibina semula dan dipaparkan oleh komputer.
- Pencahayaan konflik
Point Light Source Pencahayaan direalisasikan dengan memfokuskan sumber cahaya pada aperture kecil (pinhole) dan kemudian memfokuskannya pada sampel. Apabila aperture cukup kecil, titik pencahayaan hanya terhad oleh pembelauan, bukan oleh parameter geometri sumber cahaya dan aperture. Sumber cahaya biasa adalah sumber cahaya permukaan yang besar, jadi mustahil untuk memfokuskannya pada tempat had difraksi. Oleh itu, walaupun transmisi sangat rendah, cahaya pencahayaan yang difokuskan seperti ini masih sangat diperlukan (untuk sumber cahaya tradisional).
Rajah 1: Pencahayaan untuk pengimejan confocal. Cahaya dari sumber cahaya (LS) difokuskan pada Pinhole Pencahayaan (PI) dan kemudian memasuki sampel S ..
Laser sebagai sumber cahaya mempunyai kolimasi yang sangat tinggi (cahaya dalam laser yang baik adalah "sangat selari"). Oleh itu, laser boleh difokuskan pada tempat yang terhad difraksi melalui satu lensa tanpa menggunakan lubang pin. Oleh itu, kebanyakan mikroskop confocal tidak mempunyai pinhole pencahayaan. Kualiti tempat cahaya bergantung kepada kualiti rasuk laser. Jika kualitinya tidak baik, anda juga boleh memasukkan lubang lampu. Laser biasanya digabungkan dengan mikroskop confocal melalui serat optik. Serat ini sendiri juga bertindak sebagai pinholes.
Tumpuan dan ketumpatan tenaga tinggi laser menjadikannya sumber cahaya yang ideal untuk mikroskop confocal. Kesesuaian laser bukanlah ciri yang diperlukan untuk prestasi konfok. Sebaliknya, ia adalah satu cabaran bagi pereka optik, kerana ia akan menyebabkan corak gangguan palsu, jadi strategi reka bentuk yang berhati -hati diperlukan.
Di samping itu, hakikat bahawa laser tradisional hanya memancarkan warna tunggal (laser- "line") mempunyai batasan sendiri. Dalam pengimejan dan pengukuran multi-fluorescence, susunan multi-laser kompleks diperlukan. Laser putih mahir menyelesaikan masalah pencitraan pelbagai warna.
Rajah 2: Perbandingan confocal (kawasan kanan) dan pencitraan bukan konfocal. Dalam trophoblast tetikus Feulgen. Banyak maklumat mengenai imej bukan konfocal tidak datang dari satah fokus. Optik confocal menghapuskan semua faktor kabur dan menjadikan struktur jelas.
Pengesanan Confocal
Kebanyakan pengesan mempunyai kawasan sensitif yang agak besar (tiub photomultiplier biasanya beberapa sentimeter persegi). Optik confocal memerlukan penderiaan titik. Oleh itu, adalah perlu untuk melakukan pengesanan tempat dengan memasukkan aperture kecil (pinhole) dalam rasuk cahaya. Memfokuskan cahaya sampel pada lubang pin, mengumpul dan merakam cahaya yang dihantar.
Kerana corak difraksi bergantung kepada aperture berangka dan panjang gelombang, pengesanan pinhole diperlukan. Oleh itu, apabila parameter ini berubah, saiz pinhole mesti diselaraskan.
Apabila lensa objektif berubah (biasanya dengan perubahan aperture berangka), mikroskop pengimbasan confocal moden secara automatik akan mengubah diameter pinhole dengan sewajarnya. Oleh itu, pinholes biasanya direka sebagai aperture double atau pelbagai lapisan.
Malah, saiz lubang pinhole yang sesuai tidak hanya bergantung pada panjang gelombang dan aperture berangka, tetapi juga pada pembesaran dalaman unsur -unsur optik dalam mikroskop.
Oleh itu, ia bukan sahaja tidak diingini tetapi juga salah untuk membandingkan diameter pinhole secara langsung dalam mikroskop dengan reka bentuk yang berbeza. Sekiranya diameter pinhole tidak ditetapkan kepada nilai optimum, sistem tidak dapat melakukan pengirim optik dengan lancar (iaitu, menghantar defocus kabur), atau memotong intensiti yang tidak perlu tanpa memperoleh kualiti pengirim optik lebih lanjut (mengakibatkan imej bunyi yang tidak perlu).
Rajah 3: Pengesanan dalam pengimejan confocal. Cahaya dari sampel S difokuskan pada pinhole pemerhatian (PO) dan kemudian pada pengesan de.
Laluan optik pengimbasan confocal
Laluan rasuk confocal dalam sistem pengimbasan confocal hanya gabungan pencahayaan sumber titik dan pengesanan titik. Gabungan ini boleh digunakan sebagai pisau optik. Hanya foton dari satah fokus yang boleh dihantar ke sensor. Walaupun semua foton dari tempat lain ditapis. Pengiraan optik direalisasikan dengan cara "penapis spatial".
Kerana hanya satu tempat yang muncul pencitraan "confocal" dalam masa yang diberikan, peranti pengimbasan diperlukan untuk memindahkan tempat pada medan objek dalam mod grid. Biasanya, cermin optik dipasang pada motor pengimbasan dan digunakan untuk melaksanakan prosedur pengimbasan. Terdapat kesesakan pada masa yang diperlukan untuk mengimbas bingkai penuh (biasanya) 1,024 baris. Penambahbaikan telah dicapai dengan memperkenalkan pengimbas berkelajuan tinggi (pengimbas resonans) yang mengimbas 8, 000 atau lebih banyak baris sesaat.
Hanya di bawah teknologi mikroskop cahaya yang tercermin dapat kepingan optik yang baik dapat dicapai. Ini adalah salah satu sebab untuk perkembangan mikroskopi pendarfluor yang kuat dalam 20 tahun kebelakangan ini (sebab-sebab lain termasuk penciptaan immunostaining, DNA-hibridisasi, biosensor pendarfluor, titik kuantum dan protein pendarfluor).
Rajah 4: Dari kiri ke kanan: 1. Kon pencahayaan bukan sahaja menggembirakan pewarna pendarfluor dalam satah fokus, tetapi juga menggembirakannya ke atas dan ke bawah. Di sini diwakili oleh kerucut ganda hijau. 2. Pinhole pelepasan berkesan memintas cahaya yang dipancarkan dari atas satah fokus. 3. Selain itu, cahaya dari bawah satah fokus tidak akan melalui lubang pin. 4. Dalam sistem confocal, hanya cahaya dari sampel yang akan mencapai pengesan. Mengesan pinholes akan secara berkesan menolak sebarang cahaya dari kawasan lain. Akhirnya, bahagian optik sebenar diperolehi.
